做ELISA實(shí)驗(yàn)，這些技巧少不了!

　　介紹：

　　ELISA試劑盒在國(guó)內(nèi)有許多種叫法，例如：ELISA檢測(cè)試劑盒、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、酶聯(lián)免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等，比較常見的叫法是ELISA檢測(cè)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒等。Elisa生物試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。

　　特點(diǎn)：

　　1.高效、靈敏、特異的抗體。

　　2.穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性。

　　3.吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體。

　　4.適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等多種標(biāo)本類型。

　　5.節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。

　　操作方法

　　1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，請(qǐng)按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

　　2.根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

　　3. 加樣：不規(guī)范的移液操作可能帶來(lái)誤差。

　　1)空白孔，空白對(duì)照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗NE抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同;

　　2)標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加);

　　3)待測(cè)樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗NE抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。

　　4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

　　6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　7. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　8. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

　　9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。

　　洗板方法

　　一、手工洗板方法：

　　甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

　　二、自動(dòng)洗板：

　　如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

　　注意事項(xiàng)

　　1.從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

　　2.各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。

　　3.嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

　　4.為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。

　　5.不同批次試劑盒不能混用，如遇試劑不夠，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系客服解決

　　6.底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

　　7.中、英文說(shuō)明書或許會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。

　　8.保存溫度：2-8℃。

　　9.有效期：6個(gè)月(2-8℃)。

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